¿Cuál es el mejor fluoróforo para detectar marcadores localizados en el núcleo de la célula?
En el post de hoy, vamos a comparar differentes tipos de fluoróforos para analizar los marcadores localizados en el núcleo, y medir su diferencias. ¿Cuál es el mejor?
Para ello, usaré células PBMCs humanas y realizaré un marcaje para el factor de transcripción T-bet con el kit Cytofix/Cytoperm de BD, dejando las células toda la noche a 4°C. Este kit no está diseñado para analizar marcadores en el núcleo en tiempos de tinción cortos. Esto nos permitirá observar un aspecto interesante de la tinción intracelular, que es la relación entre el tipo de fluoróforo utilizado y la calidad de marcaje obtenido.
Bien. Empezamos con los clásicos: fluoróforos basados en PE, que poseen la mayor intensidad.
PBMCs humanas marcadas durante la noche después de la fijación con BD Cytofix/Cytoperm. Fila superior: FMOs. Fila inferior: marcaje con anticuerpos anti-T-bet. Clon indicado entre paréntesis.
A veces obtendremos un poco de marcaje inespecífico o ruido, usando los conjugados en tándem de PE. Esto generalmente se puede solucionar titulando el anticuerpo con diferentes diluciones. Para realizar esta prueba, usaré todos los anticuerpos en la misma concentración, salvo REA102, ya que no conozco la concentración. Los anticuerpos REA han sido diseñados para reducir el marcaje inespecífico y esto puede ayudar bastante.
¿Qué tal funcionan los Alexa Fluors y otros similares?
Tengo la impresión de que eFluor 660 y R718 son parientes de los Alexa Fluors, pero no estoy completamente seguro. KIRAVIA Blue 520 es bastante diferente: es un fluoróforo de cadena larga mucho más grande. Lo incluyo aquí porque está en una clase propia y necesito completar la figura.
Todos estos funcionan bien para el marcaje de proteinas localizadas en el nucleo, pero el nivel de marcaje no específico es mucho más alto con el AF594. eFluor 660 es bastante bueno para darnos una separación a todos los diferentes niveles de T-bet (probablemente podría ser mejor con un poco menos de anticuerpo). R718 probablemente no es tan brillante, pero marcaje inespecífico es mínimo. Esto es importante.
¿Qué tal los fluoróforos Brilliant? Son muy brillantes, ¿de verdad?
Estos no funcionan bien para epítopos nucleares, según mi experiencia. ¿Por qué? Bueno, son bastante grandes, por lo que podrias no pasar bien a través de los pequeños agujeros para entrar en el núcleo. No hay mucha información disponible en línea (o de BD), pero lo que podemos deducir del sitio web de BioLegend sugiere que conjugar un anticuerpo con un Brilliant Violet añadiría alrededor de 290 kDa a su masa, triplicando el tamaño del anticuerpo. PE, sin embargo, es de unos 240 kDa, y eso funciona bien. Entonces, no se trata solo del tamaño. A diferencia de PE, los tintes Brilliant son (¿probablemente?) polímeros de cadena larga, por lo que supongo que se enredan como hilos de lana. PE y particularmente sus tándems tienen algunos problemas con el fondo para la tinción nuclear, lo cual es consistente con el tamaño siendo un problema. Si son demasiado grandes, pueden entrar finalmente gracias a una incubación durante la noche, pero pueden dar problemas para salir nuevamente en un protocolo de lavados cortos.
Puedes usar fluoróforos Brilliant con otros protocolos que permeabilicen más efectivamente el núcleo, pero no sería la mejor opción incluso en esa situación.
Cuando lo grande es malo, lo pequeño conquista. Los tintes Real de BD también son moléculas pequeñas, en teoría.
Real Blue 545 es la opción más tenue. Diría que la separación es tan buena como PE. Real Blue 705 es uno de los más brillantes (Real Blue 780 y Real Blue 613 probablemente son más brillantes en el Aurora). Con ambos, no hay mucho marcaje inespecífico. Eso sugiere que el anticuerpo puede entrar para encontrar el epitopo bien, y ademas cualquier exceso puede ser eliminado efectivamente con pasos de lavado normal.
Para resumir, si tienes problemas para marcar un antígeno nuclear, prueba un conjugado con un fluoróforo pequeño y brillante. Un nanocuerpo probablemente también sería una buena opción.
Anticuerpos mencionados en esta entrada:
Quetzal, Costa Rica
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